母乳低聚糖是母乳中仅次于乳糖、脂质的第三大固态成分，能够调节婴幼儿肠道菌群、抵御病原菌、助力神经系统发育，在婴幼儿食品、功能食品等领域价值极高。LNB作为I型母乳低聚糖的核心结构单元，益生价值突出，市场应用前景广阔。但传统合成技术普遍存在缺陷，如：化学合成路线步骤繁琐、污染大、成本高；常规酶法依赖昂贵的UDP-糖基供体或ATP辅因子，反应周期极长，生产效率低；微生物细胞工厂代谢调控复杂、产物提纯难度大，长期制约LNB规模化生产。

针对上述行业痛点，中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学全国重点实验室联合天津科技大学等，聚焦二糖磷酸化酶的底物杂泛性开展研究，成功构建了一套无需ATP和UDP-糖基供体的体外生物转化体系，以廉价乳糖和N-乙酰葡糖胺为原料，实现了母乳低聚糖核心单元乳-N-二糖（Lacto-N-biose I，LNB）的低成本、高效率生物合成，为LNB及母乳低聚糖的工业化量产开辟了全新的技术路径。

研究团队挖掘嗜热菌Thermoclostridium caenicola来源的纤维二糖磷酸化酶（TcCBP），该酶天然具备乳糖磷酸解活性、副反应低、热稳定性优异。通过半理性设计与易错PCR随机突变，结合高通量筛选技术，完成TcCBP定向改造，获得最优突变体M2（N654A/Y501A）：该突变体对乳糖的活性是野生型的1.56倍，乳糖/纤维二糖底物特异性提升一倍；动力学实验证实，突变同时提升了酶对乳糖的底物亲和力与催化效率。分子动力学模拟结果阐明远端位点增强底物结合口袋周边柔性、扩大空间构象，更适配乳糖分子结合。在此基础上，将改造后的乳糖磷酸化酶M2、乳-N-二糖磷酸化酶（LnbP）与聚磷酸葡萄糖激酶（PPGK）联用，搭建三酶协同体外多酶分子机器。该体系巧妙利用磷酸化酶特性，全程摒弃ATP与UDP-糖基供体等昂贵辅因子；同时借助PPGK消耗副产物葡萄糖，推动反应平衡正向移动，大幅提升转化效率与产物分离效果。工艺优化后，该体系展现出优异的生产性能：在低底物浓度条件下产物摩尔收率可达90%；在高底物浓度条件下反应8 h，LNB终浓度可达115 g/L，摩尔收率68%，时空产率高达14.4 g/L/h，是目前已公开报道LNB合成体系中的最高水平。经核磁共振、高分辨质谱等手段表征，合成产物与LNB标准品结构完全一致，证实产物纯度与结构可靠性。

该研究首次实现以乳糖为起始原料、无外源辅酶参与的LNB高效体外生物合成，原料廉价易得、反应条件温和、工艺简洁、生产效率远超传统路线。该研究突破了LNB生物制造的核心瓶颈，拓展了二糖磷酸化酶的应用边界；构建的体外生物转化（ivBT）新范式跳出了“唯细胞论”的生物制造限制，可为各类高值寡糖的绿色生物制造提供通用解决方案。后续将继续围绕酶分子改造、酶固定化、碳循环闭环利用等方向深化研究，进一步降低生产成本、提升体系稳定性，推动技术落地工业化生产，赋能婴幼儿食品与健康食品产业升级。

该研究得到了国家重点研发计划的支持。研究成果发表于Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。论文第一作者为天津科技大学硕士研究生方浩，共同第一作者为天津工生所李元工程师，通讯作者为天津工生所张以恒研究员、天津工生所李元工程师与天津科技大学路福平教授。

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体外生物转化（ivBT）高效合成母乳低聚糖核心单元LNB