PET塑料由于其耐用、质轻等优异性能广泛应用于纺织、包装、电器等领域，但大量消费后的PET废弃物对自然界造成巨大压力。PET 废弃物的酶法解聚和回收是一种绿色可持续的资源利用策略，可以减少我们对石油资源的依赖并解决PET积累对环境的污染问题。国内外学者对PET解聚酶IsPETase进行了广泛的半理性设计与定向进化，提高IsPETase活性与热稳定性，但该酶的工程改造主要集中在由表面的环和α螺旋组成的底物结合及其周围区域，其内部β-折叠区鲜被研究。考虑到IsPETase 核心骨架的稳定性很大程度上取决于β-折叠片层与周围螺旋结构之间相互作用的紧密程度，对 β-折叠区域进行改造将有利于提高 IsPETase 的稳定性和活性。
中国科学院天津工业生物技术研究所朱蕾蕾研究员带领的蛋白质定向进化研究团队与南京中医药大学刘海峰教授合作开发了一种具有更高灵敏度的MHET-OH荧光筛选法，对IsPETase的β-折叠区域进行了系统工程改造，构建了IsPETase β-折叠区及其附近的58个氨基酸残基的随机突变文库，鉴定出位于10个位置的21个氨基酸替换突变体，这些替换具有更好的水解活性或热稳定性（图1）。随后采用顺序重组策略，将有益突变进行多轮重组，获得的最佳突变体 DepoPETaseβ 表现出卓越的解聚性能，其Tm值相对于野生型IsPETase增加了22.9°C，4天内能够在50°C的3L生物反应器中完全解聚100.5g未处理的pc-PET（0.26% Wenzyme/WPET）（图2）。最后作者对DepoPETaseβ 进行了蛋白结晶和分子动力学模拟，分析结果表明，DepoPETase β 活性和热稳定性的提高归因于 β-折叠区氢键和盐桥的增强、核心折叠和周围螺旋结构更紧密以及 PET 在活性位点的更有效结合（图3）。这项研究不仅证明了PET水解酶 β-折叠区工程化策略的重要性（图4），而且为大规模PET回收提供了一种潜在的PET水解酶。
该研究得到国家重点研发计划的支持，相关研究成果于近日发表于Engineering期刊。天津工业生物技术研究所硕士生高松枫和博士生石利霞为该论文共同第一作者，朱蕾蕾研究员、刘卫东研究员与南京中医药大学刘海峰教授为该论文共同通讯作者。
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图1. PET解聚酶IsPETase β-折叠区定向改造
图2. （a）MHET-OH荧光法的原理；（b）PETase的β-折叠区域进行系统工程改造；（c）顺序重组进行有益位点组合结果
图3. DepoPETase β对 pcPET废弃物的解聚过程
图4. 突变体DepoPETaseβ上的有益突变位点结构分析结果
