苯乙醇苷类化合物（Phenylethanoid glycoside，PhGs）是一类重要的植物天然产物，目前报道的PhGs超过500种。毛蕊花糖苷和松果菊苷是苯乙醇苷类化合物中的明星分子，是肉苁蓉、地黄和狭叶松果菊等著名药用植物中的代表性活性成分，具有神经保护、免疫调节、抗菌消炎、抗抑郁等生理功能。目前，毛蕊花糖苷和松果菊苷主要依赖于植物提取，但该方法存在生长周期长、含量低、提取工艺复杂及成本高等问题，且植物种植大量占用耕地。利用合成生物学技术，创建复杂苯乙醇苷类化合物的微生物细胞工厂进行发酵法生产，是一种非常有潜力的替代方式（图1）。
中国科学院天津工业生物技术研究所中药发酵技术研究中心团队，在前期研究中解析了植物中复杂苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷完整生物合成途径，并在大肠杆菌中实现了生物合成 (详见《天津工业生物技术研究所实现毛蕊花糖苷的微生物异源合成》)。团队进一步工程改造酿酒酵母，通过13个外源基因异源表达、代谢流调控、人工合成途径创建等手段，实现了毛蕊花糖苷和松果菊苷的高效从头合成（图2）。首先，从各种生产毛蕊花糖苷的植物中，初步筛选出酵母中催化活性增强的关键途径酶。其次，在高产对香豆酸的酿酒酵母底盘菌株中，引入包括来自不同植物来源的葡萄糖基转移酶RrUGT33、酰基转移酶SiAT、1,3-鼠李糖基转移酶SiRT、UDP-L-鼠李糖合酶AtRHM2和4-香豆酸：辅酶A连接酶At4CL1，实现关键中间体桂叶苷B的合成，产量达到21.5±1.5 mg/L。第三，研究发现红景天苷的通过增加SiAT和AtRHM2在基因组中的拷贝数，引入欧芹来源的芳香醛合酶PcAAS，将L-酪氨酸代谢流导向前体红景天苷的合成，解决香豆酰基化关键步骤的限速问题，显著提高了桂叶苷B的产量，达到320.6±59.3mg/L。第四，通过将桂叶苷B羟化酶CYP98A20和AtCPR1基因整合到桂叶苷B生产菌株的染色体上，同时增加基因拷贝数，实现了酵母合成毛蕊花糖苷，产量达到184.7±5.7 mg/L。此外，过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1），增强还原力NADPH的供给，可以将毛蕊花糖苷产量提高到230.6±11.8 mg/L。植物中松果菊苷的生物合成途径未知，通过在毛蕊花糖苷生产菌中引入来自连翘的糖基转移酶突变体FsGT61F144H，创造了松果菊苷人工合成途径，首次实现了松果菊苷微生物合成，产量达到184.2±11.2 mg/L。最后，在5升生物反应器中的补料分批发酵产生了4497.9±285.2 mg/L毛蕊花糖苷或3617.4±117.4 mg/L松果菊苷。
这项工作为毛蕊花糖苷和松果菊苷的绿色、工业和可持续生产提供了重要的基础，并为其他复杂PhGs的生产提供了新的方案。该研究展示了利用可再生原料，通过微生物细胞工厂生产高附加值复杂天然产物的巨大潜力。
该研究工作得到国家自然科学基金、合成生物学国家重点研发计划、天津市合成生物技术创新能力提升行动等项目的支持，相关研究结果发表于Metabolic Engineering杂志，并申请专利一项。天津工业生物技术研究所博士生白朋纲为该论文的第一作者，刘涛研究员为论文的通讯作者。
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图1. 创建复杂苯乙醇苷类化合物微生物细胞工厂
图2. 工程改造酿酒酵母合成毛蕊花糖苷和松果菊苷
