糖基转移酶（Glycosyltransferases，GTs）是糖苷化合物合成的核心酶，在多糖生物合成、细胞壁形成、植物内外源毒素解除、植物内激素平衡和植物次生代谢产物合成等方面发挥着重要作用。O-型糖苷因具有丰富的生物活性，是生化、制药和生物医学研究中应用最丰富和最重要的亚家族。前期研究表明，红景天（Rhodiola rosea）来源的RrUGT3以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体，可催化对羟基苯甲醇（HBA）的酚羟基位点的选择性糖基化反应生成O-型糖苷，并且具有广泛的底物谱。然而，RrUGT3详细的催化反应机理以及影响区域选择性的关键因素尚不清晰，阻碍了RrUGT3的理性设计与改造工作的开展。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所盛翔/苏浩团队与山东大学杜磊团队通过分子动力学模拟和量子化学计算方法等多尺度计算模拟方法，结合定点突变实验和晶体结构解析，阐明了RrUGT3催化反应机理以及区域选择性调控机制，为该酶的工程改造奠定了重要的理论基础。该工作通过将RrUGT3与其同源酶晶体结构进行比对，发现远离活性中心的loop区（命名为Ω-1 loop）展现出了极大的柔性，并且此结构域存在于多种UGT酶中，可能是该家族酶的普遍特征。RrUGT3定点突变实验结果表明，Ω-1 loop区上的残基Y314对酶的活性至关重要，由此推测该loop区在反应时会发生构象变化至活性中心影响催化反应，但该变化对底物的结合以及催化活性的影响机制尚未阐明。本研究利用分子动力学（MD）模拟方法探究了Ω-1 loop区构象变化的微观机制。计算结果表明，在酶与底物的结合过程中，Ω-1 loop区会发生从“open”到“closed”的构象变化。这一构象变化是形成稳定的酶-底物三元复合物的关键，该三元复合物只有在Ω-1 loop区“closed”状态下才能稳定存在。另外，该状态下残基Y314可通过水桥与糖受体HBA形成氢键并将糖受体稳定在活性位点，有利于糖基化反应的发生。

基于“closed”状态的酶-底物三元复合物，本研究进一步采用量子力学/分子力学（QM/MM）组合方法和量子化学（QC）团簇方法解析了其化学反应机理及区域选择性调控机制。计算结果表明，HBA酚羟基和醇羟基位点糖基化的反应能垒分别为15.5 kcal/mol和19.8 kcal/mol，因此反应更倾向于发生酚羟基糖基化反应，与实验结果趋向一致。基于计算结果，本研究提出了酚羟基糖基化较稳定的底物结合模式和较低的反应活化能是影响RrUGT3具有区域选择性的原因。此外，RrUGT3的催化能力主要源自于其底物结合口袋的极性微环境，它有利于UDPG的焦磷酸根处于单质子化状态从而促进反应发生。该项研究获得了RrUGT3酶催化过程中构象变化和化学反应机理等诸多重要信息，拓宽了对UGT酶催化机制的认识，为开展UGT酶的理性设计和改造工作提供了重要的理论指导，并为非天然O-糖苷的制备提供了新的思路。

该工作获得国家重点研发计划、天津市合成生物技术创新能力提升行动和国家自然科学基金的支持，相关研究成果近期发表在英国皇家化学会期刊Catalysis Science &Technology上。天津工业生物所与天津科技大学联合培养硕士研究生李梦莎、山东大学的游偲和郭斐为论文的共同第一作者，天津工业生物所盛翔研究员和苏浩副研究员、山东大学杜磊研究员为该论文的共同通讯作者。

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RrUGT3野生型及突变体催化活性和不同复合物状态下Ω-1 loop区构象变化的自由能曲线