葡萄糖二酸是葡萄糖的一种二元羧酸衍生物，是重要的平台化合物，被广泛用于医药、化工等领域。2004年，美国能源部将葡萄糖二酸列为“12大高值化生物基平台化合物”之一。目前，葡萄糖二酸主要以葡萄糖为底物通过硝酸氧化法生产，反应条件剧烈、化学选择性低、产品产率低，同时生成大量有毒副产物NO。2019年，美国初创公司Kalion，Inc.因为开发利用微生物发酵生产葡萄糖二酸的新工艺，获得了美国环保署EAP绿色化学总统奖：小企业奖。但是，该微生物发酵法没有实现工业化生产，关键原因包括得率低、浓度低、反应速度慢等。

中国科学院天津工业生物技术研究所张以恒研究员带领的体外合成生物学中心团队，利用体外生物转化（in vitro BioTransformation，ivBT）的方法通过多种策略显著提高了葡萄糖二酸的产量，证明了利用ivBT技术合成高得率与高浓度葡萄糖二酸的能力。

体外合成生物学是合成生物学的重要组成部分，其中ivBT是体外合成生物学的生物制造平台，介于微生物发酵与酶分子催化之间。多酶分子机器是ivBT的特有生物催化剂，是基于化繁为简原则，将多个天然酶、人工酶以及（仿生）辅酶等重构体外人工代谢途径，摆脱生物体自我繁殖的局限，超越细胞合成极限，实现重要生物化学合成，高效低成本生产大宗生化产品。基于体外合成生物学技术生产肌醇产业化成功的前期基础上，团队开发了一种高效从淀粉合成葡萄糖二酸的新方法。该方法为“一锅三步转化”，包括（1）五种嗜热酶（即异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡糖异构酶、肌醇1-磷酸合成酶和肌醇1-磷酸酶）将淀粉合成肌醇，（2）常温酶肌醇氧化酶将肌醇转化到葡萄糖醛酸，（3）常温醛酸脱氢酶和NADH氧化酶合成葡萄糖二酸。通过采用分阶段反应和逐步添加酶的组合策略实现了在“一锅法转化”中，以麦芽糊精为底物，葡萄糖二酸钠盐产量约为9.66 g/L，原子效率高达96.6%。在高底物浓度下，通过采用分阶段反应、逐步添加酶、控制pH和氧气供给的新组合策略，在配有pH控制器和搅拌的生物反应器中实现了D-葡萄糖酸钠盐滴度高达52.1 g/L，为文献中报道的最高滴度。该研究代表ivBT在产业化过程的新应用，为葡萄糖二酸工业生物制造指出新方向。

通过多维优化策略，该研究证实ivBT合成高得率与高滴度葡萄糖二酸的潜力。无论微生物发酵还是ivBT合成葡萄糖二酸，其中肌醇氧化酶是最重要的酶。目前肌醇氧化酶具有较低的比酶活性和稳定性，导致需要大量酶催化和较长的反应时间。因此，未来研究可以对肌醇氧化酶作进一步改进，主要包括：（1）挖掘性能更优异的酶；（2）利用理性设计、定向进化和基于人工智能的蛋白质工程等手段对肌醇氧化酶进行改造以提升其性能；（3）酶的固定化。

该研究工作得到国家重点研发计划专项和天津市合成生物技术创新能力提升行动的支持。研究成果发表在Organic Process Research & Development。中国科学院天津工业生物技术研究所助理研究员李元为论文的第一作者，张以恒研究员为论文的通讯作者。

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通过多种策略组合利用体外生物转化技术合成高得率与高浓度葡萄糖二酸