聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料具有成本低、便携、稳定、气密性好、透明度高等优点，广泛应用于纺织行业、家用电器及食品包装等领域。但其在自然界中难以解聚，造成了比较严重的环境污染。目前，废弃塑料的有效回收与再利用已成为全球性的研究热点，PET的酶促解聚为废弃塑料的回收利用提供了一条绿色途径。IsPETase是近年来报道在常温下对PET水解活性最高的酶，但其稳定性较差，引起了国内外学者的广泛研究，基于IsPETase晶体结构的（半）理性改造已成功获得一系列催化性能提升的突变体。定向进化也是提高IsPETase催化性能的一种有效方法，可以挖掘出远离活性位点的潜在有益突变位点，但IsPETase缺乏高效灵敏的高通量筛选方法。 

　　针对上述PET水解酶定向进化缺乏高通量筛选方法的技术瓶颈，中国科学院天津工业生物技术研究所朱蕾蕾研究员带领的蛋白质定向进化研究团队与南京中医药大学刘海峰教授合作，首次发展了以PET结构类似物为底物，基于荧光检测的PETase水解活性微孔板筛选方法。科研人员巧妙地设计了一种新型化合物BHET-OH（PET寡聚物BHET的衍生物），其被PETase水解后可以生成带有荧光信号的产物TPA-OH，对反应体系的连续荧光检测可以快速测定PETase的水解活性，该荧光法也适用于其他PET水解酶。随后基于建立的筛选方法，对PETase进行多轮定向进化，T_m值提高了23.3°C，收获了对无定型PET膜的水解活力大幅度提高的最佳突变体DepoPETase。DepoPETase在中温下实现了多种PET 废弃包装的完全解聚，同时其水解活性与稳定性通过了3L发酵罐中19.1 g PET废弃包装完全解聚的升级放大实验的验证。最后作者通过分子动力学模拟阐释了该酶的催化性能提升的机理，发现DepoPETase的有益突变主要是通过疏水作用、盐桥、氢键等相互作用，增强催化三联体附近的6个loop的网络相互作用，进而将稳定效应传递到活性中心，从而提高该酶的催化性能。该工作通过定向进化技术和新颖的高通量筛选方法提高了IsPETase的PET水解活性和热稳定性，为PET水解酶的分子改造提供了新思路和新方法，也为PET的酶降解循环利用提供了高效的酶催化剂。 

    该研究得到国家重点研发计划、天津市合成生物技术创新能力提升行动、中科院STS项目的支持，相关研究成果于近日发表在Angewandte Chemie International Edition期刊上。天津工业生物所博士生石利霞和副研究员刘岯为该论文共同第一作者，朱蕾蕾研究员与南京中医药大学刘海峰教授为该论文共同通讯作者。 

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基于荧光筛选方法的PET的定向进化研究结果