氨基酸是生命体蛋白质的基本组成单元，广泛用于饲料、食品、医药和日化领域。过去几年，世界氨基酸市场复合增长率约为5.6%，预计2022年总销售量将超过800万吨，产值超过1000亿元。氨基酸工业是我国生物制造的支柱产业之一，而高水平的工业菌种被认为是生物制造的“芯片”。系统与合成生物技术的发展极大地提升了对工程菌种的设计和创制能力，但是从头创建工业水平的菌种仍然较为困难。核心限制是缺乏高效的工业微生物基因组编辑技术和高性能的催化、调控、转运等功能元件。 

　　近日，中国科学院天津工业生物技术研究所系统与合成生物技术研究组和系统生物学平台实验室合作，在基于合成生物学的氨基酸高产菌种从头设计创制方面取得重要进展。该工作以氨基酸工业的主力菌种谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和高附加值氨基酸L-脯氨酸为研究的对象，在以下几方面取得突破： 

　　（1）针对谷氨酸棒杆菌基因组编辑存在的效率低、Cas9毒性高等问题，通过转录-翻译多级调控Cas9表达的严谨性和表达量，实现了基于双链DNA模板的高效基因敲除和敲入，常规编辑效率最高>90%，219 kb大片段敲除效率>30%；通过优化噬菌体重组蛋白RecT依赖的单链DNA重组，基因突变效率可达100%，编辑效率和操作的简便性较现有方法大幅提升。 

　　（2）L-脯氨酸合成关键酶γ-谷氨酸激酶ProB活性受L-脯氨酸反馈抑制，且反馈抑制与底物结合位于相同区域，设计改造较为困难。针对该问题，对UniProt数据库中900余条ProB序列进行序列保守性分析，结合晶体结构模拟锁定解除反馈抑制的潜在位点，基于上述单链DNA重组技术在染色体原位构建了5个氨基酸位点的饱和突变库，成功筛选到较已报道最优突变体的L-脯氨酸产量提升24%的新突变体。 

　　（3）为设计具有最高原子经济性的L-脯氨酸合成途径，预测关键的代谢流控制靶点，基于基因组规模代谢网络模型进行了代谢流量平衡分析；通过引入异源的NADP⁺依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶GapN，葡萄糖合成L-脯氨酸的理论转化率可由0.86 mol/mol提高至0.98 mol/mol，L-脯氨酸终端合成途径基因、草酰乙酸回补途径基因和上述GapN是关键的流量控制靶点。 

　　（4）为在染色体上精细调控关键基因的表达，构建了谷氨酸棒杆菌多个天然启动子的突变体文库，基于荧光成像系统筛选获得具有梯度表达强度，且最高强度提升>40倍的启动子文库；应用启动子文库精细调控上述流量控制基因的表达，大幅提升了流向目标产物L-脯氨酸的代谢流量。 

　　（5）针对L-脯氨酸外排蛋白未知，无法开展转运工程研究的问题，构建了谷氨酸棒杆菌全部397个膜转运蛋白基因的CRISPRi阵列文库，成功筛选到目前唯一一个L-脯氨酸外排蛋白Cgl2622；并通过增强产物L-脯氨酸外排，阻断合成前体L-谷氨酸外排的转运工程策略，构建获得高产菌株PRO-19，采用工业原料5 L罐分批补料发酵，L-脯氨酸产量达到142.4 g/L，生产强度2.90 g/L/h，转化率0.31 g/g，为目前文献报道的最高水平，具有工业化应用前景。 

　　该研究综合运用代谢途径设计、基因组编辑、关键酶改造、基因精细表达调控和新型功能元件挖掘等技术手段，从头创制了无质粒、没有抗生素抗性标记、无需诱导剂的L-脯氨酸高产谷氨酸棒杆菌。多位审稿人对该工作给与了高度评价，认为本论文不仅报道了有价值的高产菌种，还提供了从头创制工业菌种的通用流程。 

　　该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省重点研发计划、中科院青促会、天津市“项目+团队”重点培养专项、天津市合成生物技术创新能力提升行动等项目的支持，并得到天津工业生物所高通量编辑与筛选平台实验室、生物设计中心和生物催化与绿色化工团队的帮助。相关研究成果已经发表在国际重要期刊Nature Communications上，天津工业生物所高级工程师刘娇、天津工业生物所与天津科技大学联合培养硕士研究生刘莫识为论文的共同第一作者，王钰副研究员和郑平研究员为论文的共同通讯作者。 

    文章链接

L-脯氨酸外排蛋白的CRISPRi筛选及功能鉴定