CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术，为生命科学的研究提供了革命性的工具，为生物技术在医药、农业、工业领域的应用迎来了新机遇。但是在很多真核生物中，由于缺乏向导RNA高效表达方法，CRISPR/Cas9系统的建立和应用受到很大制约。黑曲霉是一种重要的工业微生物，其产品柠檬酸、酶制剂等在食品、医药、化工等领域用途广泛，然而目前仍然无法实现对黑曲霉的高效基因组编辑，限制了其工程应用潜力的发挥。 

　　近日，中国科学院天津工业生物技术研究所孙际宾研究员带领的系统生物学中心与郑平研究员带领的系统与合成生物技术研究团队合作，首次在重要工业微生物黑曲霉中提出以核糖体5S rRNA基因为启动子介导sgRNA的表达，开发了一种基于5S rRNA的新型高效的CRISPR/Cas9系统，使Cas9对黑曲霉基因组定点切割效率可达100%。以此建立了黑曲霉高效基因组编辑工具包，以40 bp的短同源臂供体DNA可以简便地实现单位点、多位点的基因敲入以及长至48 kb的大片段DNA敲除等基因组精准编辑。该新型CRISPR/Cas9系统有效解决了黑曲霉sgRNA的活性表达问题，突破了黑曲霉基因组高效编辑的瓶颈，为认识黑曲霉工业潜力的生物学分子基础，进一步提升其工业应用性能，开发新型细胞工厂和新产品提供了强有力的技术支撑。同时，由于核糖体5S rRNA的高度保守性，在任意生物中都可以快速找到其5S rRNA基因，基于5S rRNA的向导RNA表达策略的提出，为解决真核生物向导RNA表达难题、实现CRISPR/Cas9基因组编辑系统在各种真核生物的建立和应用开辟了普适性的新思路。 

　　该研究得到国家自然科学基金以及中国科学院相关项目的支持，相关研究成果已发表在期刊ACS Synthetic Biology。天津工业生物技术所助理研究员郑小梅博士为论文的第一作者。 

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图1 应用不同的guide RNA表达策略的CRISPR/Cas9系统介导黑曲霉albA基因失活 

（A）CRISPR/Cas9系统介导的albA基因失活的基因组编辑过程示意图；（B）5S rRNA基因启动guide RNA表达的核心序列鉴定；（C）不同启动子策略对albA基因失活效率的影响。 

图2 基于5S rRNA的CRISPR/Cas9系统介导的黑曲霉基因组精准编辑效率

图3 基于5S rRNA的CRISPR/Cas9系统实现黑曲霉基因组编辑的实验流程示例