供稿部门：系统与合成生物技术实验室，系统生物分析实验室，高通量新分子生物合成实验室 

　　CRISPR/Cas9系统极大的丰富了原核生物的基因组编辑方法。但是，由于CRISPR/Cas9系统高效的致死筛选能力和原核生物普遍的低同源重组效率，多靶点和自动化的基因组编辑仍难以实现，严重限制了菌株的遗传改造效率。 

　　近日，中科院天津工业生物所郑平研究员带领的系统与合成生物技术团队、孙际宾研究员带领的系统生物分析团队，以及王猛研究员带领的高通量新分子生物合成团队合作，在重要工业平台微生物谷氨酸棒杆菌中开发了多元自动化基因组编辑方法MACBETH（Multiplex Automated Corynebacterium glutamicum Base Editing Method）。该方法结合CRISPR/Cas9系统的定位功能与胞嘧啶脱氨酶（AID）的碱基编辑功能，可在染色体靶位点实现从C到T的编辑，编辑效率高达90%。MACBETH可同时在多个基因中生成提前的终止密码子，以失活靶基因。在天津工业生物所的自动化平台上，可实现从质粒构建、基因组编辑、获取正确突变株和表型验证的全流程自动化操作，编辑能力可达到每月数千突变株。作为示例，MACBETH用于一次性构建94个调控因子单独失活的菌株库，成功率达到100%。由于不需要额外提供DNA模板，该方法可降低基因组编辑难度与成本，并可在不影响基因组结构的前提下，快速构建全基因组规模的单基因失活菌株库，有望加快谷氨酸棒杆菌的基础和应用研究，为将谷氨酸棒杆菌改造为通用的微生物底盘提供强大的技术支持。同时，该方法为在其他原核生物中实现多靶点和自动化的基因组编辑提供了参考。 

　　该研究得到国家自然科学基金、中科院前沿科学重点研究项目、中科院重点部署项目和天津市特支计划项目的支持，相关研究成果已经发表在Metabolic Engineering期刊。天津工业生物所助理研究员王钰和研究实习员刘叶为论文的共同第一作者。 

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MACBETH基因组编辑示意图

（a）不同Cas9-AID-gRNA复合体与靶基因的作用关系示意图；（b）不同Cas9-AID-gRNA复合体对靶基因的编辑效率；（c）upp基因编辑后的基因型分析；（d）rfp基因编辑后的基因型分析；（e）rfp基因编辑后的表型分析