谷氨酸棒杆菌是一个重要的氨基酸生产菌株，其氨基酸产量超过400万吨/年，近年来被广泛用于生产各种天然和非天然产物，预计到2020年其发酵产品市值达204亿美元。传统的工业菌株主要依赖长期的理化诱变及筛选获得，在基因组水平实现快速、高效的理性编辑依然是谷氨酸棒杆菌代谢工程改造的难点。  

　　近日，中科院天津工业生物技术研究所孙际宾和郑平研究员带领的系统与合成生物技术研究团队，开发了谷氨酸棒杆菌的CRISPR/Cas9基因组编辑工具。首先，该研究通过重构Cas9和gRNA的表达盒解决了Cas9毒性和gRNA自身转录终止子无法终止的问题，在谷氨酸棒杆菌中实现了基于CRISPR/Cas9的高效反向筛选。其次，采用共转化Cas9和gRNA表达质粒避免了cas9基因的高频突变，成功实现质粒提供模板的高效基因编辑（图1），敲除和插入效率分别高达60%和62.5%，同时简化操作并节省时间。最后，开发了CRISPR/Cas9和RecT介导的ssDNA重组技术（图2），可以在基因组上精确地引入小范围突变及单碱基突变，单位点编辑效率超过80%，双位点编辑效率高达40%。该编辑工具在模式菌株谷氨酸棒杆ATCC 13032等多株谷氨酸棒杆菌中具有普适性，可以显著提升谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造水平，促进其作为工业底盘生产各种生物基化学品和生物燃料。 

　　该研究得到国家自然科学基金、中科院重点部署项目和天津市特支计划项目的支持，相关研究成果已经发表在Microb Cell Fact期刊。天津工业生物所的刘娇助理研究员和王钰助理研究员为论文的共同第一作者。 

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质粒提供模板的基因编辑及Cas9的突变分析

CRISPR/Cas9和RecT介导的ssDNA重组编辑