普鲁兰酶是一种重要的工业用酶，可专一水解直链淀粉中的a-1,6-糖苷键，大量应用于淀粉糖化生产过程中，在高直链淀粉、高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和干啤酒等生产等也具有广泛的应用。 

　　天津工业生物所宋诙研究组从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌，普鲁兰糖水解分析结果确定该酶为I型普鲁兰酶。16S rDNA序列系统进化树分析的结果确定该菌为Anoxybacillus属种，并从中克隆获得了编码上述耐热普鲁兰酶的基因（Accession No. HQ844266），将该基因在大肠杆菌中进行了表达、纯化及分析。酶学性质分析的结果显示，该酶的最适温度为60℃，最适pH范围5.6-6.4。同时，该酶具有良好的热稳定性，在60℃下处理48小时，仍可保持50%以上的活力；酶促反应动力学分析显示，在pH 5.8（NaAc-HAc buffer）、60℃，以普鲁兰糖为底物的条件下，该酶的Vmax和Km分别为750 U/mg和1.47 mg/ml，是目前文献报道中比活力最高的耐热普鲁兰酶。 

　　研究组还对该酶进行了晶体X-ray衍射分析，晶体结构解析的结果显示该酶具有淀粉酶13家族中典型的催化中心活性结构域；并首次在同类酶中发现N端具有一个独立的底物结合域，该结构域的缺失导致比活力和底物结合力的降低，Vmax和Km分别为324 U/mg和1.95 mg/ml。在序列及晶体结构分析的基础上，通过对该酶进行理性设计改造，得到了一系列稳定性更好的突变体，其中突变体（T470A/Y175C/Delete(580-584)）的T₅₀值比野生型提高了4℃，在65℃下的t_1/2是野生型的4倍，能更好的满足工业的应用。 

　　同时，研究组将该普鲁兰酶编码基因克隆到pBE980载体，在枯草芽孢杆菌中普鲁兰酶基因获得了异源高效表达，通过培养基优化，在优化培养基（starch 37 g/L, peptone 15.5 g/L, CaCl₂ 1.5 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.2 g/L, NaCl 2 g/L, FeSO₄ 0.05 g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.5 g/L, pH 7.0）中摇瓶培养，胞外酶活可达350 U/mL。以上研究结果为普鲁兰酶制剂的国产化生产和应用奠定了良好的基础。 

　　研究成果发表于《生物工程学报》。

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