甲醇低价易得、能量密度高，可以利用CO2、生物质为原料规模化生产，是生物制造理想的非粮替代原料。甲醇芽孢杆菌是可高效利用甲醇作为唯一碳源和能源的天然甲基营养菌，并能够适应50℃高温和海水培养基，在甲醇等一碳原料的生物转化利用中拥有极大的应用潜力。但是关于甲醇芽孢杆菌的研究仍然比较初步，尤其是缺乏高效的基因组编辑、生物设计等使能技术，严重阻碍了该一碳生物制造新底盘的开发应用。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所王钰研究员带领的有机一碳生物代谢与转化研究组开发了一套系统的甲醇芽孢杆菌合成生物学使能技术：包括高效的DNA电转化方法、基于热稳定CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术、用于基因稳定表达的染色体中性位点，以及用户友好的生物设计工具（图1）。团队利用该工具包系统解析了甲醇芽孢杆菌的质粒依赖型甲醇代谢的遗传机制等基础科学问题，构建了无质粒、表型稳定的工程底盘，并改造底盘首次实现了以甲醇为唯一碳源生产L-精氨酸。

研究团队首先系统优化了甲醇芽孢杆菌的DNA电转化方法，将转化效率较原方法提升1000倍，为遗传操作奠定基础。通过比较不同热稳定CRISPR-Cas9系统的PAM在甲醇芽孢杆菌基因组上的数量和分布，选择ThermoCas9进行基因编辑测试（图2）。结果表明，该系统具有超过98%的靶向致死率，使用1 kb同源臂即可实现高效的基因组敲除，敲除4 kb以内片段的效率接近100%，并可实现40 kb大片段的敲除以及双基因的同时敲除。

利用该系统，研究团队对甲醇芽孢杆菌内源质粒pBM19和pBM69，以及染色体上的甲醇代谢基因拷贝进行了敲除，研究它们在甲基营养和限制性修饰中的生理功能。结果表明，pBM19质粒携带6个甲醇代谢基因，质粒敲除菌完全丧失了在甲醇无机盐培养基中生长的能力，而携带限制性内切酶BmeTI的pBM69质粒的敲除菌可以显著提高无m6A甲基化质粒的转化效率。此外，染色体拷贝的3-己酮糖-6-磷酸合成酶编码基因hps、6-磷酸-3-己酮糖异构酶编码基因phi以及磷酸果糖激酶编码基因pfk的单敲除菌株几乎完全阻断了甲醇代谢，表明染色体拷贝的这些基因对甲醇代谢的重要性。

此外，研究团队鉴定和评估了12个用于基因稳定整合和表达的染色体中性位点。它们在不同条件下对菌体生长影响较小，并具有不同的表达水平，为基因表达的精细调控提供了广泛选择。研究团队将对甲醇代谢至关重要的19 kb大质粒pBM19整合至中性位点进行表达，同时敲除内源质粒，获得了无质粒的新型工程底盘。通过适应性进化，该底盘展现出稳定且强健的生长特性，既避免了质粒丢失风险，也消除了菌株退化的隐患（图3）。

最后，研究团队还与马红武研究员带领的生物设计中心合作，构建了甲醇芽孢杆菌的基因组规模代谢网络模型iBM822，并将其整合至CAVE和QHEPath等途径可视化与途径设计云平台上，方便研究人员使用。利用该模型模拟预测了甲醇芽孢杆菌代谢甲醇合成L-精氨酸的代谢途径，并通过基因敲除和过表达研究了L-精氨酸合成的调控机制，构建得到利用甲醇生产L-精氨酸的初代工程菌。

该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、天津市杰出青年科学基金等项目的支持。相关成果已发表于Cell Reports。中国科学院天津工业生物技术研究所博士后刘盼和生物设计中心副研究员袁倩倩为论文的共同第一作者，王钰研究员为通讯作者。

论文链接

图1 甲醇芽孢杆菌的合成生物学使能技术

图2 甲醇芽孢杆菌CRISPR-ThermoCas9基因编辑系统

图3 无质粒甲醇芽孢杆菌底盘的生长和稳定性测试

（A）野生菌WT、pBM19整合菌株C19-1及其进化菌株在甲醇无机盐培养基中的生长测试；（B）C19-1在递减蛋白胨有机氮源的甲醇无机盐培养基中的适应性进化；（C）野生菌WT和pBM19整合菌株C19-1中pBM19携带基因的稳定性测试